Desenvolvimento de um método potenciométrico para deteção de salmonella typhimurium

A Salmonella é um microrganismo responsável por grande parte das doenças alimentares, podendo por em causa a saúde pública da área contaminada. Uma deteção rápida, eficiente e altamente sensível e extremamente importante, sendo um campo em franco desenvolvimento e alvo de variados e múltiplos estudos na comunidade cientifica atual. Foi desenvolvido um método potenciométrico para a deteção de Salmonellas, com elétrodos seletivos de iões, construídos em laboratório com pontas de micropipetas, fios de prata e sensores com composição otimizada. O elétrodo indicador escolhido foi um ESI seletivo a cadmio, para redução da probabilidade de interferências no método, devido a pouca abundancia do cadmio em amostras alimentares. Elétrodos seletivos a sódio, elétrodos de Ag/AgCl de simples e de dupla juncão foram também construídos e caracterizados para serem aplicados como elétrodos de referência. Adicionalmente otimizaram-se as condições operacionais para a analise potenciométrica, nomeadamente o elétrodo de referencia utilizado, condicionamento dos elétrodos, efeito do pH e volume da solução amostra. A capacidade de realizar leituras em volumes muito pequenos com limites de deteção na ordem dos micromolares por parte dos ESI de membrana polimérica, foi integrada num ensaio com um formato nao competitivo ELISA tipo sanduiche, utilizando um anticorpo primário ligado a nanopartículas de Fe@Au, permitindo a separação dos complexos anticorpo-antigénio formados dos restantes componentes em cada etapa do ensaio, pela simples aplicação de um campo magnético. O anticorpo secundário foi marcado com nanocristais de CdS, que são bastante estáveis e é fácil a transformação em Cd2+ livre, permitindo a leitura potenciométrica. Foram testadas várias concentrações de peroxido de hidrogénio e o efeito da luz para otimizar a dissolução de CdS. O método desenvolvido permitiu traçar curvas de calibração com soluções de Salmonellas incubadas em PBS (pH 4,4) em que o limite de deteção foi de 1100 CFU/mL e de 20 CFU/mL, utilizando volumes de amostra de 10 ƒÊL e 100 ƒÊL, respetivamente para o intervalo de linearidade de 10 a 108 CFU/mL. O método foi aplicado a uma amostra de leite bovino. A taxa de recuperação media obtida foi de 93,7% } 2,8 (media } desvio padrão), tendo em conta dois ensaios de recuperação efetuados (com duas replicas cada), utilizando um volume de amostra de 100 ƒÊL e concentrações de 100 e 1000 CFU/mL de Salmonella incubada.Salmonella is an organism responsible for the majority of foodborne illness, which may concern public health from contaminated area. A fast, efficient and highly sensitive detection are extremely important, being a rapidly developing field and today is a target in varied and multiple studies in the scientific community. We developed a potentiometric method for detection of Salmonella with ion-selective electrodes, built in the laboratory with micropipettes tips, silver wires and optimized sensors compositions. The indicator electrode chosen was highly selective for cadmium, to reduce the likelihood of interference in the method, due to the low abundance of cadmium in food samples. Microelectrodes sodium electrodes, Ag/AgCl single and double junction electrodes have also been constructed and characterized to be applied as reference electrode. In addition was optimized the operating conditions for potentiometric analyses, like a particular reference electrode, conditioning of the electrodes, the effect of pH and volume of the sample solution. The capacity of reading in very small volumes with limits of detection in the order of micromolar by the ESI polymeric membrane has been integrated in a test using a format ELISA noncompetitive sandwich using a primary antibody labeled with nanoparticles of Fe@Au, allowing separation of antibody-antigen complexes formed from the remaining components at each step of the assay, by the simple application of a magnetic field. The secondary antibody was labeled with CdS nanocrystals that are stable and easy processing into free Cd2+, enabling the potentiometric reading. We tested various concentrations of hydrogen peroxide and the effect of light to optimize the dissolution of CdS NC. The method developed allows us to trace calibration curves made with solutions of Salmonella incubated in PBS (pH 4.4) with different concentrations, having reached the limits of detection of 1100 CFU/mL and 20 CFU/mL using sample volumes of 10 ìL and 100 ìL, respectively, in the linearity interval of 10 to 108 CFU/mL. The average recovery rate obtained was 93.7% ± 2.8 (mean ± standard deviation) taking into account two assays recovery made (each one with two replicates) using 100 ìL sample volume and concentrations of 100 and 1000 CFU/mL of incubated Salmonella